Khảo sát khả năng kháng khuẩn Vibrio Parahaemolyticus của cao chiết rau đắng đất (Glinus Oppositifolius) trồng tại tỉnh Trà Vinh

TÓM TẮT:

Nghiên cứu đã khảo sát thành phần cao chiết rau đắng đất (Glinus Oppositifolius) được trồng tại tỉnh Trà Vinh, kết quả cao chiết chứa các nhóm chất saponin, flavonoid, tannin. Qua khảo sát đã xác định được quy trình ly trích cao tối ưu ở các điều kiện: thời gian ly trích là 4 giờ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/40 (g/mL). Nghiên cứu cho thấy cao ethanol của rau đắng đất cho khả năng ức chế mạnh vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus. Phần trăm ức chế của cao chiết ở các nồng độ 500 - 1000ppm rất cao (gần như hoàn toàn), vi khuẩn không thể phát triển được trong 48h khảo sát so với các mẫu khảo sát ở các nồng độ thấp hơn (250; 125; 62,5ppm).

Từ khóa: Glinus Oppositifolius, rau đắng đất, Vibrio Parahaemolyticus, DPPH, Extract, tỉnh Trà Vinh.

1. Đặt vấn đề

Rau đắng đất là loài thực vật có hoa, thuộc họ Bình cu (Molluginaceae) và có tên khoa học là Glinus Oppositifolius (L.) theo mô tả của Aug. DC. vào năm 1901. Rau đắng đất được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới như châu Phi, Ấn Độ, Phillipines,… Ở Việt Nam, rau đắng đất được phân bố dọc theo các tỉnh ven biển từ Nam Định đến đồng bằng sông Cửu Long.

Hình 1: Rau đắng đất

Rau đắng đất chứa nhiều các hợp chất: flavonoid, saponin, tannin, đường, tinh dầu, một ít alkaloid, triterpenoid tự do; ngoài ra còn có các carotenoid, các axit hữu cơ, chất khử [1].

Hiện nay, trên thế giới cũng có rất nhiều nghiên cứu về cây rau đắng đất, điển hình là nghiên cứu của Juliana Janet R. Martin-Puzon và cộng sự, kết quả nghiên cứu cho thấy, các cao chiết từ lá của cây rau đắng đất có thể chống lại các vi khuẩn Gram âm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Acinetobacter baumanii [2].  Đặc biệt, khi nghiên cứu về bào chế gel vi nhũ tương từ cao khô của cây rau đắng đất, kết quả chỉ ra vi nhũ tương rau đắng đất ở pH bằng 4.527 có kích thước hạt trung bình 14nm và bền sau chu kỳ 6 ngày sốc nhiệt. Gel vi nhũ tương từ rau đắng đất đạt các chỉ tiêu vật lý và thể hiện khả năng kháng khuẩn in vitro khi thử nghiệm trên Pseudomonas aeruginosa [3].

Vibrio parahaemolyticus là một loại vi khuẩn Gram âm, phát triển mạnh ở vùng khí hậu ấm áp trong môi trường biển hoặc cửa sông. Nó thường được tìm thấy khi bơi tự do, bám vào các bề mặt nước, hoặc liên kết với các loài động vật khác nhau.

Hình 2: Vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus

Vibrio Parahaemolyticus sinh sống và phát triển tốt trong môi trường kiềm và mặn, tồn tại trong nước biển và các động vật biển như: tôm, cá, ốc, sò,… Chúng có khả năng ký sinh trong đường ruột của tôm và tiết ra độc tố làm gan tụy của tôm sưng hoặc teo lại mềm nhũn và làm tôm chết hàng loạt, gây thiệt hại gần như hoàn toàn cho vụ nuôi [4].

Sirilak Kamonwannasit và cộng sự (2020) đã nghiên cứu thành phần và hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết rau đắng đất. Kết quả nghiên cứu cho thấy, tiềm năng phát triển các chất kháng khuẩn từ các chất chuyển hóa thứ cấp như saponin và flavonoid [5]. Nhưng hiện tại trên thế giới vẫn chưa có nghiên cứu nào về khả năng kháng khuẩn của cao chiết cây rau đắng đất đối với vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus.

Xuất phát từ các vấn đề trên, việc khảo sát khả năng kháng khuẩn vibrio parahaemolyticus của cao chiết cây rau đắng đất (Glinus Oppositifolius) trồng tại Trà Vinh được xem xét thực hiện, làm cơ sở khoa học ban đầu cho việc ứng dụng các nguồn hoạt chất thiên nhiên vào sản xuất.

2. Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

2.1. Phương tiện nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu

Mẫu rau đắng đất được thu gom từ các hộ dân trồng tại địa bàn tỉnh Trà Vinh. Mẫu sau khi thu hoạch được sơ chế, bảo quản lạnh ở 4^oC và lưu trữ để sử dụng cho tất cả các thí nghiệm.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng

Hóa chất gồm: Nutrient Broth (Ấn Độ), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (Merck), Ethanol (TQ), Agar (Việt Nam) và các hóa chất cơ bản cần thiết khác.

Thiết bị sử dụng gồm: Nồi hấp tiệt trùng STUDY SA-300VF, máy quang phổ UV-Vis Shimadzu 1800, kính hiển vi Kruss,…

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Nghiên cứu quy trình ly trích cao chiết rau đắng đất

Trong nghiên cứu này đã sử dụng kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration). Rau đắng đất sau khi đủ 60 ngày tuổi, tiến hành thu hái, rửa sạch, phơi khô và xay nhuyễn để đạt kích thước đồng đều, thuận lợi cho quá trình chiết ngâm dầm.

Hình 3:  Sơ đồ quy trình điều chế cao chiết rau đắng đất

Hiệu suất quá trình điều chế cao chiết rau đắng đất được tính theo công thức: 

Hiệu suất cao chiết (%) = [khối lượng cao chiết/khối lượng mẫu]*100

2.2.2. Định tính thành phần hóa học của các cao chiết rau đắng đất bằng phương pháp hóa học

Tannin: sử dụng thuốc thử Pb(CH₃COO)₂ trong định tính tannin. Pha chế thuốc thử Pb(CH₃COO)₂ bằng cách cho từ từ Pb(CH₃COO)₂ vào cốc thủy tinh chứa 10mL nước cất đến khi bão hòa. Cho dịch chiết rau đắng đất tác dụng với thuốc thử Pb(CH₃COO)₂ bão hòa, có sự xuất hiện của tannin trong cao chiết rau đắng đất khi phản ứng có tạo kết tủa xanh lá hoặc xanh đen.

Saponin: sử dụng thuốc thử NaOH trong định tính saponin, dùng 5mL dung dịch NaOH 0.1N và 1mL dịch chiết rau đắng đất, tiếp tục bịt kính ống nghiệm và lắc mạnh, sau đó để yên khoảng 15 phút, có sự xuất hiện của saponin trong cao chiết rau đắng đất khi có hiện tượng tạo bọt bền.   

Flavonoid: sử dụng FeCl₃ trong định tính flavonoid, hút 2mL dung dịch cao chiết rau đắng đất cho vào ống nghiệm, sau đó nhỏ vài giọt dung dịch FeCl₃ 5% vào ống nghiệm, có sự có mặt của flavonoid khi ống nghiệm xuất hiện màu lục, xanh hoặc nâu (tùy vào số lượng nhóm OH trong phân tử flavonoid).

2.2.3. Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết rau đắng đất

Đường độ hấp thu theo nồng độ của cao chiết rau đắng đất trong dung môi được pha ở nồng độ từ 50 - 250µg/mL trong dung dịch DPPH 40µg/mL, cho dung dịch phản ứng trong 30 phút ở điều kiện thiếu sáng. Sau đó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm bằng máy quang phổ UV-Vis.

2.2.4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Vibrio Parahaemolyticus của cao chiết rau đắng đất

Vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus được nuôi trong môi trường Nutrient Broth. Cao chiết rau đắng đất trong dung môi nước được sử dụng cấy vào môi trường Nutrient Broth có vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus với nồng độ ban đầu là 1000ppm, pha loãng các nồng độ tiếp theo với tỷ lệ 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 và 1/16, tiến hành ủ ở nhiệt độ 37^oC trong thời gian 48 giờ và thực hiện lặp lại 3 lần ứng với từng nồng độ cao chiết. Nồng độ tối thiểu của cao chiết được xác định là nồng độ thấp nhất có thể ức chế vi khuẩn phát triển.

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Kết quả khảo sát quy trình ly trích cao chiết rau đắng đất

3.1.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi được thể hiện trên Hình 4.

Hình 4: Biểu đồ thể hiện kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Kết quả khảo sát cho thấy, hiệu suất tạo cao chiết phụ thuộc vào tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi càng lớn càng làm giảm quá trình hoàn tan các hoạt chất. Giảm tỷ lệ nguyên liệu/dung môi giúp quá trình ly trích được được thực hiện dễ dàng hơn, tuy nhiên tỷ lệ mẫu/dung môi quá thấp sẽ gây khó khăn trong quá trình thu hồi cao chiết. Dựa vào bảng khảo sát trên cho thấy tỷ lệ 1/40 thu được hiệu suất cao nhất. Kết quả nghiên cứu thấp hơn kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Kim Yến và cộng sự (tỷ lệ tối ưu là 1/15.295) [7]. Tuy nhiên trong nghiên cứu này không sử dụng phương pháp vi sóng trong quá trình chiết, vì vậy phù hợp với rất nhiều điều kiện của các phòng thí nghiệm. Do đó, tỷ lệ 1/40 được lựa chọn làm thông số tối ưu cho quá trình ly trích cao chiết rau đắng đất.

3.1.2. Kết quả khảo sát thời gian ngâm đến hiệu suất ly trích cao chiết rau đắng đất

Thời gian ly trích ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất tạo cao, thời gian ngắn quá trình hòa tan các hoạt chất trong rau đắng đất không hoàn toàn. Tuy nhiên, thời gian quá dài sẽ làm giảm chất lượng cao chiết, do ảnh hưởng của môi trường khảo sát và sự phân hủy của các hợp chất kém bền. Dựa vào biểu đồ Hình 5 cho thấy, hàm lượng cao chiết tăng khi tăng thời gian khảo sát từ 2 giờ đến 4 giờ và lượng cao thu được có dấu hiệu giảm khi tăng thời gian khảo sát từ 4 giờ đến 6 giờ. Vì vậy, lựa chọn thời gian ly trích tối ưu là 4 giờ để đảm bảo chất lượng cao chiết.

Hình 5: Biểu đồ thể hiện kết quả khảo sát thời gian ly trích 

3.2. Kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết rau đắng đất bằng phương pháp hóa học

3.2.1. Kết quả định tính tannin

Pha chế thuốc thử Pb(CH₃COO)₂ bằng cách cho từ từ Pb(CH₃COO)₂ vào cốc thủy tinh chứa 10mL nước cất đến khi bão hòa. Hút 2mL dịch chiết rau đắng đất lần lượt cho vào 2 ống nghiệm, sau đó nhỏ từng giọt thuốc thử Pb(CH₃COO)₂ bão hòa vào ống nghiệm số 2 thu được kết quả trên Hình 6. Ống nghiệm 2 xuất hiện màu xanh đen cho thấy trong cao chiết rau đắng đất có tannin.

Hình 6: Kết quả định tính tannin

3.2.2. Kết quả định tính saponin

Hút 2mL dung dịch cao chiết rau đắng đất cho vào ống nghiệm 1, cho 1mL dung dịch NaOH 0.1N vào ống nghiệm 2, sau đó hút 1mL dịch chiết rau đắng đất vào ống nghiệm số 2, tiếp tục bịt kín ống nghiệm số 2 và lắc mạnh, sau đó để yên khoảng 15 phút thu được kết quả Hình 7. Ống nghiệm 2 có hiện tượng tạo bọt bền cho thấy có sự hiện diện của saponin trong cao chiết rau đắng đất.

Hình 7: Kết quả định tính saponin

3.2.3. Kết quả định tính flavonoid

Hút 2mL cao chiết rau đắng đất vào ống nghiệm 1 và ống nghiệm 2, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl₃ 5% vào ống nghiệm số 2 thu được kết quả Hình 8. Ống nghiệm số 2 có hiện tượng xuất hiện kết tủa màu xanh đen cho thấy trong cao chiết rau đắng đất có flavonoid.

Hình 8: Kết quả định tính flavonoid

Kết quả định tính thành phần hóa học của cao chiết rau đắng đất cho thấy, thành phần cao có chứa các hợp chất: tannin, saponin và flavonoid, kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã công bố [6].

3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết rau đắng đất

Dựa vào kết quả biểu đồ kháng DPPH của cao chiết rau đắng đất trong nước ở Hình 9, ta thu được giá trị IC₅₀ của cao chiết rau đắng đất là 169.663 µg/mL. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết rau đắng đất cao hơn so với cao chiết vỏ và thịt quả dứa xanh, dứa chín [8] và cao hơn cao chiết vỏ và thịt hạt bơ [9].

Hình 9: Biểu đồ thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết rau đắng đất trong dung môi nước

3.4. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn Vibrio Parahaemolyticus của cao chiết rau đắng đất

Hình 10: Kết quả ức chế Vibrio Parahaemolyticus của cao chiết rau đắng đất phương pháp khuyết tán giếng thạch

Hình 10 cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus từ 5 mẫu cao chiết rau đắng đất dung môi nước ở các nồng độ là 1000ppm giảm dần xuống 62.5 ppm (mẫu tỷ lệ 1/16). Cao chiết từ cây rau đắng đất có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio Parahemolyticus gây bệnh gan cấp trên tôm thẻ chân trắng phân lập tại phòng thí nghiệm Trường Đại học Trà Vinh. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết giảm dần theo thời gian thử nghiệm từ 0 đến 48 giờ. Nồng độ tối thiểu ức chế đối với vi khuẩn Vibrio Parahemolyticus là 250 ppm, nồng độ ức chế hiệu quả là 500pm. Kết quả này chứng tỏ cao chiết xuất rau đắng đất có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio Parahemolyticus rất hiệu quả so với nghiên cứu đã công bố trước đây [10].

4. Kết luận

Nghiên cứu đã thực hiện định tính thành phần cao chiết rau đắng đất, kết quả cho thấy, có sự hiện diện của các nhóm: saponin, flavonoid, tannin trong cao chiết. Đồng thời, đã xác định được quy trình ly trích cao tối ưu ở các điều kiện như sau: Thời gian ly trích: 4 giờ, tỷ lệ rắn/lỏng: 1/40 (g/mL). Đã khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng.

Từ đó có thể đánh giá tiềm năng ứng dụng của cao chiết rau đắng đất trong nuôi trồng thủy hải sản.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. Vũ Thị Hoài (2022). Đặc điểm hình thái và giải phẫu của một số mẫu giống rau đắng đất Glinus Oppositifolius (L.). Tạp chí Khoa học & và Công nghệ Việt Nam, 20(7), 873-882.
2. Juliana Janet R. Martin-Puzon (2019). TLC profiles and antibacterial activity of Glinus Oppositifolius L. Aug. DC. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 5, 569-574.
3. Nguyễn Thị Kim Liên (2019). Bào chế gel vi nhũ tương từ cao khô rau đắng đất [Glinus Oppositifolius (L.) Aug. DC., Molluginaceae]. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 5, 11-15.
4. Nguyễn Trọng Nghĩa, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trương Quốc Phú và Phạm Anh Tuấn (2015). Phân lập và xác định khả năng gây hoại tử gan tụy của vi khuẩn vibrio paraheamolyticus phân lập từ tôm nuôi ở bạc liêu. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học, 39, 99-107.
5. Sirilak Kamonwannasit (2020). Screening of phytochemicals and Antibacterial activities of various extracts of Sadao din (Glinus Oppositifolius). RSU International Research Conference, 2020, 564-570.
6. Nguyễn Thị Thu Hiền, Lê Thiện Đại, Hà Mỹ Nhân, Đặng Chí Cường (2020). Khảo sát đặc điểm vi học, thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa của rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) A. DC.). Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 10, 47-51.
7. Phạm Thị Kim Yến, Hoàng Đức Duy, Hoàng Thị Ngọc Nhơn (2020). Tối ưu hóa ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình trích ly Flavonoid trong rau đắng đất (Glinus oppositifolius). Tạp chí Công Thương, 18, 89-94.
8. Nguyễn Thị Thu Hậu, và các cộng sự (2019). Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa từ cao chiết ethanol vỏ và thịt quả dứa (Ananas Comosus) ở giai đoạn xanh và chín trồng tại vùng Tắc Cậu - Kiên Giang. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2020, 2020, 194-199.
9. Huỳnh Ngọc Trung Dung, và các cộng sự (2019). Khảo sát sơ bộ hoạt tính sinh học của cao chiết từ vỏ và hạt bơ (Persea americana, L.). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 55 (Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học, 1, 98-103.
10. Võ Thị Tú Anh, và các cộng sự (2021). Thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của các cao chiết cây sổ trai (Dillenia ovata). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 57(3A), 97-105.

INVESTIGATING THE RESISTANCE

TO VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS OF THE EXTRACT

FROM BITTER GOURD GROWN IN TRA VINH PROVINCE

• Master. NGUYEN THIEN THAO

Faculty of Applied Chemistry, Tra Vinh University  

ABSTRACT:

This study investigates the composition of the extract from bitter gourd (Glinus Oppositifolius) grown in Tra Vinh province. The study finds that the extract has Saponin, Flavonoid, and Tannin substances. The optimal extraction process has been determined under the following conditions: the extraction time of 4 hours, and the raw material-solvent ratio of 1/40 (g/mL). The study also finds that the bitter gourd extract strongly inhibits Vibrio Parahaemolyticus. The percentage inhibition of extracts at concentrations of 500-1000ppm is very high (almost completely). Bacteria could not grow in 48 hours of investigation compared to samples at lower concentrations (250; 125; 62.5ppm).

Keywords: Glinus Oppositifolius, bitter gourd, Vibrio Parahaemolyticus, DPPH, extract, Tra Vinh province.

[Tạp chí Công Thương - Các kết quả nghiên cứu khoa học và ứng dụng công nghệ, Số 13 tháng 5 năm 2023]